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 culture invitro

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safia
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مُساهمةموضوع: culture invitro   الجمعة سبتمبر 09, 2011 3:41 am

Sommaires :
I-Introduction :
- Rappel Historique

II-Définition de culture in vitro ou multiplication in vitro :
• Le principe
1-Présentation de différentes techniques

III-Cultures de méristème des plantes horticoles :
1- Petit rappel historique sur le développement de ce type de culture
• But

2- Petite définition de méristème et leurs différents types
• Rôle de méristèmes
2-1-Le prélèvement de méristème
• Manipulation de prélèvement
2-2- Milieux de culture
2-2-a_ Constituant
2-2-b_ Préparation de milieux de culture
2-2-c_ Les différents types des milieux de culture

3- Conditions de croissance :
3-1- Environnement
• La lumière
• L’humidité relative
• La température
• L’esprit
3-2-Taux de réussite
• Facteurs techniques
• Facteurs physiologiques
• Facteurs pathologiques (biologiques)

4- Les contrôles nécessaires :

IV-Application horticoles ou les intérêts de la technique
V-Un exemple de la culture de méristème
- Le crosne du Japon (stackys seiboldii mig)

VI-Conclusion :
I-Introduction :
- Rappel historique :
On a toujours le sentiment que les techniques de la culture in vitro sont très récentes et fruit de la technologie moderne .Ce sentiment n’est qu’en partie exact car s’il est vrai que certaines méthodes et l’utilisation généralisée de celle-ci sont récentes les premières tentatives de culture remontent au début du XXe siècle voici quelques points de repère :
En 1902 : 1er survie in vitro mais pas de multiplication
En 1932 : 1er culture indéfinie de racine
En 1946 : 1er culture de méristème
En 1952 : 1er régénération de plantes atteintes de virus à partir de méristème (dahlia, pomme de terre, fraisier)
En 1954 : 1er culture de cellule isolées (protoplaste)
En : 1980transferts de gène (tentatives et réussites)
En 2000 : sur un certain nombre d’espèces.
































II-Définition de cultures in vitro ou multiplication in vitro :
Le terme culture in vitro est appliqué à toute culture sous verre (tube, bocal…etc.) en milieu aseptique, mais il regroupe plusieurs techniques dont les méthodes et les buts sont très différents.
• Le principe : le principe général consiste à prélever un fragment de tissu végétal, à le placer sur un milieu nutritif et provoques (grâce a un équilibre adéquate des éléments du milieu) directement ou après manipulation, le développement d’une plantule .l’ensembles de ces opération qui se déroule en condition stérile est suivi d’une acclimations climat sur un milieu traditionnel.
RQ : La culture in vitro est possible grâce a une propriété des cellules végétales appelée totipotence cellulaire.
II-1-Présentation de différentes techniques :
Les cultures in vitro se présentent sous (4) quatre aspects :
-1-a- Micro propagation
-1-b- Culture d’antennes de grains de pollen et d’ovules
-1-c- Culture de protoplaste
-1-d- Culture de méristème
III-Cultures des méristèmes des plantes horticole :
1-petit rappel historique sur le développement de ce type de culture(culture des méristèmes) :
G. Morel et C. Martini ont essayés les première de cultiver des méristèmes en conditions aseptiques sur un milieu gélosé.la plante choisie était un Dahlia virose atteint de « ring spot »et de « mosaïque » ; les méristèmes mis en culture ont produit des jeunes tiges qui greffées sur des plants sains, ont montré que certaines d’entre elle ne contenaient plus de virus .Le premier succès a été suivi de très nombreux autre et il a ouvert la voie à l’utilisation de la technique de culture in vitro en horticulture.
Les raisons qui font que dans la grande majorité des cas les méristèmes apicaux des plantes sont indemne de virus. On évoque pour cette particularité l’hypothèse suivante : La vitesse de multiplication des cellules méristématique qui en quelque sorte et en simplifiant, se multiplieraient plus vite que le virus, laissant quelques cellules saines.
A bute : est la régénération d’espèces atteintes de virus.
2-Petite définition des méristèmes et leurs différents types :
Le terme de méristème désigne un ensemble de cellules indifférenciées qui ont une capacité de division très élevée.
On peut définir les méristèmes comme des sites privilégiés localisent qui assurent une prolifération cellulaire non spécialisée à l’ origine.
RQ : toute fois il existe toujours sur la plante des sites particuliers gardant une activité histogène ou organogène : les méristèmes
-Les méristèmes sont situés dans différents sites. Il existe diverse catégories de méristèmes que l’on classe en fonction de leurs aptitudes :
-Il y a des méristèmes responsables de la croissance en longueur des tiges et des racines (méristèmes apicaux) ; d’autres assurent la croissance en épaisseur des tiges chez les plantes vasculaires (méristèmes secondaires ou cambium) .Les deux méristèmes qui sont les facteurs de base de croissance des plantules, le méristème caulinaire qui donnera l’appareil souterrain, Ensuite avec le temps, le végétal doit assurer son grossissement, mais dans le cas de la culture de méristème ,seuls les méristèmes caulinaires (situés à l’extrémité des tiges) sont utilisés.
-Les méristèmes jouent un rôle très important lors de la multiplication végétative, et jouent également un grand rôle dans le cas de multiplication spontanée.
(Stolons, bulbilles aériennes, phénomène dite de viviparité.
2-1-Le prélèvement des méristèmes :
Remarque : la technique ne s’applique pratiquement que pour les espèces a multiplication végétative, celle-ci favorisant l’extension des viroses ; pour les espèces multipliées par semis , le risque de transmission existe mais il est très limites ;de ce fait ,la culture de méristèmes ne présente pas d’intérêt.
- La manipulation de prélèvement :
-Sur les pieds-mères choisis, on prélève des boutures à l’extrémité des rameaux (utiliser des outils stérilisés) ; celles-ci peuvent être, selon les cas, désinfectées ou non, par exemple la désinfection n’est pas utile pour le chrysanthème, l’œillet, le crosne du japon. Elle est utile généralement, pour les espèces acaules (saintpaulia, gerbera).les boutures sont conservées dans bain d’eau stérile. Le prélèvement peut se faire sous une hotte stérile ou plus simplement sur une paillasse désinfectée .Une loupe binoculaire est débarrassée de ses jeunes feuilles, puis à l’aide d’une lame montée sur un manche d’horloger on enlève les très jeunes feuilles en les écartant vers l’extérieur : elles se cassent généralement d’elles-mêmes à leur base. Les outils utilisés sont changés fréquemment et doivent être flambés avant usage (le flambage complète la stérilisation par l’alcool).quand le méristème est visible (dôme plus réfringent on élimine délicatement les dernière ébauches, puis l’on découpe un minuscule cube dont les faces sont tau gentes aux méristèmes, La dernière section transversale va isoler le méristème ; la coupe doit passer juste sous l’anneau initial. Le méristème (0,2 à 0,3 mm de côté) se trouve sur la lame ou le repique immédiatement sur un milieu gélosé contenu dans un tube à hémolyse.
Remarque importante ; toutes les opérations précitées doivent se faire dans le minimum de temps pour éviter le dessèchement mais aussi limiter les risques de contamination.






















III-2-2-Milieux de culture :
2-2-a- Constituants :
• Eau :
On utilise en générale de l’eau déminéralisée ou de l’eau permutée.
• Sels minéraux :
Comme pour les cultures traditionnelles on trouvera des macroéléments les cations NH4, K, ca, Mg et les anions No3, Po4, So4 a des concentrations variant.
• Microéléments :
Fer(Fe), manganèse(Mg), Bore(B), Zinc(Zn), Molybdène(Mb), Nickel(Nk), Aluminium(Al).
Concentration de l’ordre de quelques milligrammes par litre.
• Sucre :
Ils apportent les glucides nécessaires au métabolisme on amène en général du saccharose ou du glucose a des concentrations variant, la plante n’étant pas capable de photo synthétises a ce stade.
• Vitamines :
Elles favorisent le développement des plantes in vitro, on utilise généralement de la vitamine du groupe B : Thiamine, Pyridoxine, Biotine, Méro-inosital a des concentrations de l’ordre 1mg par litre.
• Régulateurs de croissance :
• Produits divers
On ajoute parfois du lait de coco, du « jus » de banane, du jus d’ananas,…etc. Ces substances apportent des régulateurs, mais aussi des acides aminés.
Du charbon actif est quelque fois utilisé pour ses qualités de « detoxifiant ».
Gélose (ou AGAR-AGAR).
Extraite d’algues, elle assure un support solide transparent aux explants.
2-2-b- Préparation de milieux de culture :
D’une manière générale, le milieu doit être assez riche en éléments minéraux, en particulier en potassium (K) dont la teneur doit être plus élevée que pour un milieu de multiplication végétative, de ce point de vue, le milieu de MURASHIGE et SKOOG convient bien.
Tableau page 164
















Le teneur en sucre est de l’ordre de 2 à 6% selon les espèces et les autre composants du milieu sont nécessaires (Fer, Vitamines, le groupe B, Migos-éléments) pour une bonne croissance, mais peu de particularités ont été montrées quant à leur concentration le milieu est le plus souvent gélosé (6 à 10 g/L) mais il peut être liquide dans ce cas les échanges entre explant et milieu sont meilleurs , mais il conviendra de prévoir une aération (en générale par agitation) pour éviter l’asphyxie.
Enfin, les régulateurs de croissance seront, comme cela été montré précédemment, les déterminants de la réussite.
En général, une auxine (AIA, ANA, AIB, 24D) est indispensable avec quelque fois des traces de Cytokine pour permettre la multiplication cellulaire de plus, très souvent une gibbérelline est nécessaire pour assurer l’élongation de l’axe le méristème appartient au groupe des explants de type organisé.
Le milieu est coulé en tubes à hémolyse (le volume d’air au-dessus du méristème est petit, cela limite le dessèchement) puis auto clavé
Après mise en culture, les tubes sont placés à la lumière moyenne et dans température.
• Résultat :
Dans ces conditions, si le milieu est favorable on observera la croissance d’une jeune tige puis des racines apparaitront ou non selon les espèces. Si la plantule est complète comme par exemple pour l’œillet, le chrysanthème, le saintpaulia, le crosne du japon –elle peut être soit repiquée sur un substrat pour acclimatation, soit multipliée in vitro pour avoir un plus grand nombre de plantes.
Si la plantule est limitée à la tige, comme chez l’Actinidia, le Gerbera ou le Rosier, il faudra passer par un milieu d’enracinement avant passer à la multiplication ou à l’acclimations.
2-2-c- Les différents types des milieux de culture :
Théoriquement, chaque plante et chaque technique demandent un milieu particulier mais certains sont relativement polyvalents. Le milieu départ sa composition, est un élément important dans la réussite d’une culture in vitro ainsi qui le sérieux avec lequel il est préparé. Il est important pour chaque mise en culture d’établir une fiche ou sont notés outre la composition la nature de l’explant, la technique et les produits de désinfection, le PH, la température, l’intensité et la durée de l’éclairement, toutes ces notions permettant éventuellement une analyse de ce qui a été fait et en cas d’échec il est ainsi plus facile de repérer les points douteux et d’apporter les corrections nécessaires .Exemple de désinfection d’un explant (bourgeon de chrysanthème).
10 secondes : Alcool à 70°
Rinçage à l’eau stérile
20 minutes : Hypochlorite de calcium (4%)
Rinçage successifs à l’eau stérile
Mise en culture.
Tableau Image



















III. 3- Conditions de croissance :
3-1- Environnement :
• La lumière : n’est pas strictement indispensable pour une bonne croissance des méristèmes mais sa présence donne de meilleurs résultats. Les intensités apportées sont comprise entre 1000 et 3000 LUX. Un régime de 16 heures de jour pour 08 heures de nuit, est souvent adopté bien qu’un éclairage en continu soit possible.
• L’humidité : relative doit être proche de la saturation.
Les tubes étant en générale fermés pour des raisons sanitaires. On arrive très facilement à ce résultat sans problème.
• La température : doit être impérativement contrôlée, d’où l’utilité d’une chambre de culture en moyenne entre 22° et 25° C.
Image page 167

























• L’asepsie : conditionne la réussite. Il faut donc :
- Stériliser le milieu
- désinfecter très fréquemment le matériel de prélèvement
- éviter au minimum les risques de contamination en travaillant rapidement sur paillasse désinfectée ou en milieu stérile (hotte à flux laminaire).
3-2- Taux de réussite :
Il est très variable et le taux de régénération varie de 0 à 80%, les causes de cette variation sont très diverses.
• Facteurs techniques :
Les méristèmes étant de très petite taille de l’ordre de 1/10 de mm, il arrive très souvent que des tissus voisins soient prélevés en même temps.
• Facteurs physiologiques :
L’état du pied-mère à une grande importance. En générale, le taux de réussite est supérieur pour les espèces herbacées ; Quand les méristèmes sont prélevés sur des axes en croissance active, le taux de régénération ou de guérison atteint 80 à 90% de l’effectif ; par contre, ce taux peut descendre à 05 ou 10% quand le prélèvement se fait sur des axes en croissance ralentie.
Chez les espèces ligneuses, cette façon de faire est difficilement applicables car les méristèmes excisée sur des rameaux en croissance brunissent rapidement dans le milieu de culture et meurent. En revanche, les prélèvements de méristèmes sur des bourgeons au repos, mais dormance levée, donnent une croissance et de meilleurs résultats en culture, mais le taux de régénération ou de guérison ne peut être que très faible.
• Facteurs pathologiques (biologique) :
Le taux de régénération est en relation directe avec le statut viral. D’une part nous l’avons vu, certains virus peuvent être présents dans les méristèmes, alors que d’autres sont très facilement éliminés, et d’autre part, chez certaines espèces on note au sein même des tissus la présence de nombreuses bactéries (la plupart non pathogènes) qui vont se développer dans le milieu et infecter la culture (l’élimination des virus est difficile) par exemple les Hortensias (particulièrement) et le pélargonium abritent de nombreuses bactéries et le taux d’infection peut être très élevé (plus de 99% quelque fois pour l’hortensia). Dans le cas de réussite nulle on peut associer la thermothérapie et la culture de méristème.
On place la plante à régénérer à la température d’élimination du virus pendant le temps voulu, puis on pratique un prélèvement de méristème sur cette plante.
Exemple : Dianthus caryophyllus (œillet) ou l’élimination du steak de l’œillet se pratique par cette double méthode :
Tableau : sélection sanitaire sur œillet :
Page 168 + image



























Remarque : dans la technique l’important n’est pas tellement le pourcentage de réussite mais la possibilité d’obtenir quelques plants sains qui pourront servir d’être multiplier végétativement.
III-4- Les contrôles nécessaires :
La culture de méristème peut permettre d’obtenir des plantes indemnes, il est impératif de vérifier l’état sanitaire de la plante obtenue (vérifier par des contrôles rigoureux que les virus ont été éliminés).Ces contrôles sont fait avec des techniques d’indexages sur des plantes sensibles aux virus, en général trois indexage sont réalisés pour avoir l’assurance d’une régénération totale. Il est également important de vérifier la conformité génétique de la plante obtenue. Ce contrôle visuel doit établir qu’aucune mutation n’a eu lieu.
L’indexage : il est possible d’utiliser des méthodes sérologiques ou immunologiques qui demandent un équipement plus élaboré ; elles sont plus spécifiques et permettent de tester des virus connus.
- Il est à remarquer que les premiers stades de croissance d’un méristème sont semblables à ceux d’une plantule issue de semis, ce qui semble mettre en évidence le phénomène de rajeunissement signalé précédemment.
A la fois : le contrôle sanitaire renseigne sur la présence ou l’absence de virus.
IV- Application horticoles ou les intérêts de la technique :
- Les cultures horticoles exigent souvent des investissements importants, d’où l’intérêt d’une bonne rentabilité des cultures installées. Cette rentabilité dépend en partie de la qualité des pieds –mères ou des jeunes plants.
- Les cultures de méristème ont permis la régénération d’un certain nombre d’espèces, permettant ainsi de disposer de pieds-mères sains assurant la production de bouture sans virus.
Exemple : Dianthus caryophyllus, chrysanthemum, pelar gonium x hortoum ,orchidées, dahlia,rabus idaeus, solanum tuberosum, ribes, prunus, fragaria.
- Outre la régénération, la culture de méristèmes est parfois utilisée comme point de départ pour la micro propagation pour quelques espèces ainsi que pour la multiplication de certaines espèces d’orchidée.
- Les cultures de méristèmes et la micro propagation ont nettement raccourci la durée de la culture et le temps de mise à fleur. Elles facilitent grandement la programmation des dates de floraison.
- Le prélèvement d’un méristème, puis sa mise en culture permettent dans de nombreux cas de régénérer un pie-mère qui retrouve alors son aptitude au bouturage. Ce phénomène est parfois dénommé «juvénilisation »
Exemples : se quoi adendron, taxodium distichum.
- Régénération sanitaire
C’est le domaine ou la culture de méristèmes trouve toute son efficacité. De nombreux genres victimes de problèmes sanitaires ont été débarrassés de virus, bactéries, champignons vasculaires…toute fois, les plantes régénérer ne sont pas immunisés et il faut rester vigilant quant aux re-contaminations possibles.
• Ré juvénilisation du matériel végétal :
Pieds-mères plus vigoureux plus productifs, meilleur taux de reprise.
V-Un exemple de culture de méristème :
• Le crosne du japon (stachys siebodii mig)










































• Les images de crosne du japon et les étapes de manipulation :












































VI- Conclusion :





La possibilité de produire des plantes indemnes devrait permettre un regain d’intérêt pour ce type de culture qui reste encore assez discret dans notre pays.




































Bibliographie :





- Dominique boutherin et Gilbert Bron ; professeur au lycée agricole et horticole d’Angers-Les Fresnes (2002), multiplication des plantes horticoles, Londres, paris, New York, édition Tec et Doc, 2eme édition.



































Glossaire :




- 2,4D : Acide dickloro – 2,4 phénoxyl acétique
- AIA : Acide B indole acétique
- AIB : Acide B indole butyrique
- ANA : Acide x naphtylacetique
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مُساهمةموضوع: رد: culture invitro   الجمعة سبتمبر 09, 2011 3:56 am

يعطيكي العافية زميلة على المشاركة....واهلا وسهلا فيكي....
موضوعزراعة الانسجة من المواضيع المهم لاهل الزراعة.....
كنا منتمنى انه يكون الموضوع يحمل ترجمة ايضا باللغة العربية لتحقيق الفائدة المطلوبة....
لانه متل ما بتعرفي اللي بيقدروا يقروا موضوع علمي بالفرنسي عددهم قليل...
فاذا بتقدري تترجمي فكرة كل فقرة سنكون ممنونين كتير منك....
وطبعا نحن ممنونين حتى ولو ما قدرتي ترجميه....
اهلا وسهلا فيكي وبمشاركاتك....
مع التحية queen

____________________________________________
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